Споделихме няколко съображения миналата седмица за използването на електрофореза с целулозна ацетатна мембрана и ще завършим тази тема днес за ваша справка.
Избор на Буферна концентрация
Концентрацията на буфера, използвана при електрофорезата с целулозна ацетатна мембрана, обикновено е по-ниска от тази, използвана при електрофорезата с хартия. Често използваното pH 8,6Bарбиталният буфер обикновено се избира в диапазона от 0,05 mol/L до 0,09 mol/L. При избора на концентрация се прави предварителна оценка. Например, ако дължината на мембранната лента между електродите в камерата за електрофореза е 8-10 cm, е необходимо напрежение от 25 V на сантиметър от дължината на мембраната, а интензитетът на тока трябва да бъде 0,4-0,5 mA на сантиметър от ширината на мембраната. Ако тези стойности не бъдат постигнати или надвишени по време на електрофореза, концентрацията на буфера трябва да се увеличи или разреди.
Прекалено ниската буферна концентрация ще доведе до бързо движение на лентите и увеличаване на ширината на лентата. От друга страна, прекалено високата буферна концентрация ще забави миграцията на лентата, което ще затрудни разграничаването на определени разделителни ленти.
Трябва да се отбележи, че при електрофорезата с целулозна ацетатна мембрана значителна част от тока се провежда през пробата, което генерира значително количество топлина. Понякога избраната буферна концентрация може да се счита за подходяща. Въпреки това, при условия на повишена температура на околната среда или при използване на по-високо напрежение, изпарението на водата поради топлината може да се засили, което води до прекалено висока концентрация на буфер и дори причинява изсъхване на мембраната.
Обем на пробата
При електрофорезата с целулозна ацетатна мембрана обемът на пробата се определя от различни фактори, включително условия на електрофореза, свойства на самата проба, методи на оцветяване и техники за откриване. Като общ принцип, колкото по-чувствителен е методът за откриване, толкова по-малък може да бъде обемът на пробата, което е благоприятно за разделяне. Ако обемът на пробата е прекомерен, моделите на електрофоретично разделяне може да не са ясни и оцветяването също може да отнеме много време. Въпреки това, когато се анализират количествено отделените оцветени ленти, като се използват методи за колориметрично откриване на елуиране, обемът на пробата не трябва да бъде твърде малък, тъй като може да доведе до по-ниски стойности на абсорбция за определени компоненти, което води до по-големи грешки при изчисляване на тяхното съдържание. В такива случаи обемът на пробата трябва да бъде увеличен по подходящ начин.
Обикновено обемът на пробата, добавен на всеки сантиметър от линията за нанасяне на пробата, варира от 0,1 до 5 μL, еквивалентно на количество на пробата от 5 до 1000 μg. Например, при рутинен анализ на електрофореза на серумен протеин, обемът на пробата, добавен на всеки сантиметър от линията на приложение, обикновено не надвишава 1 μL, еквивалентен на 60 до 80 μg протеин. Въпреки това, когато се анализират липопротеини или гликопротеини с помощта на същия метод на електрофореза, обемът на пробата трябва да бъде съответно увеличен.
В заключение, най-подходящият обем на пробата трябва да бъде избран въз основа на специфични условия чрез серия от предварителни експерименти.
Избор на разтвор за оцветяване
Отделените ленти при електрофореза с целулозна ацетатна мембрана обикновено се оцветяват преди откриване. Различните компоненти на пробата изискват различни методи на оцветяване и методите на оцветяване, подходящи за електрофореза с целулозна ацетатна мембрана, може да не са напълно приложими за филтърна хартия.
Има три основни принципа за избор на разтвор за оцветяванемембрана от целулозен ацетат. първо,Водоразтворимите багрила трябва да се предпочитат пред алкохолоразтворимите багрила, за да се избегне свиването на мембраната и деформацията, причинена от оцветяващия разтвор на последния. След оцветяването е важно мембраната да се изплакне с вода и да се сведе до минимум продължителността на оцветяването. В противен случай мембраната може да се извие или свие, което би повлияло на последващото откриване.
Второ, за предпочитане е да изберете багрила със силен афинитет на оцветяване за пробата. При електрофореза с целулозна ацетатна мембрана на серумни протеини обикновено се използва амино черно 10В поради неговия силен афинитет на оцветяване към различни компоненти на серумния протеин и неговата стабилност.
Трето, трябва да се изберат надеждни качествени багрила. Някои бои, въпреки че имат същото име, могат да съдържат примеси, които водят до особено тъмен фон след оцветяване. Това дори може да замъгли първоначално добре разделените ленти, което ги прави трудни за разграничаване.
И накрая, важен е изборът на концентрация на оцветяващия разтвор. Теоретично може да изглежда, че по-висока концентрация на оцветяващ разтвор би довела до по-щателно оцветяване на компонентите на пробата и по-добри резултати от оцветяването. Това обаче не е така. Афинитетът на свързване между компонентите на пробата и багрилото има определена граница, която не се увеличава с увеличаване на концентрацията на оцветяващия разтвор. Напротив, прекалено високата концентрация на оцветяващия разтвор не само губи багрилото, но и затруднява постигането на ясен фон. Освен това, когато интензитетът на цвета достигне определена максимална стойност, кривата на абсорбция на багрилото не следва линейна зависимост, особено при количествени измервания. При електрофореза с целулозна ацетатна мембрана концентрацията на оцветяващия разтвор обикновено е по-ниска от тази, използвана при електрофореза на хартия.
Подробности, които трябва да знаете за Beijing Liuyi Biotechnology's мембрана от целулозен ацетатрезервоар за електрофореза и неговото приложение за електрофореза, моля, посетете тук:
лЕксперимент за разделяне на серумен протеин чрез целулозна ацетатна мембрана
лЕлектрофореза с целулозна ацетатна мембрана
Ако имате някакъв план за закупуване на нашите продукти, моля, не се колебайте да се свържете с нас. Можете да ни изпратите съобщение на имейл[имейл защитен]или[имейл защитен], или моля, обадете ни се на +86 15810650221 или добавете Whatsapp +86 15810650221, или Wechat: 15810650221.
Справка:Електрофореза (второ издание) от г-н Ли
Време на публикуване: 6 юни 2023 г